IF:6.7,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+實驗驗證,揭示補腎健脾調(diào)血湯改善子宮衰老的機制?。?!
題目:補腎健脾調(diào)血湯(BJTD)通過激活SIRT1/NRF2通路改善子宮衰老誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡
英文名:Bushen Jianpi Tiaoxue Decoction (BJTD) ameliorates oxidative stress and apoptosis induced by uterus ageing through activation of the SIRT1/NRF2 pathway
雜志:Phytomedicine
影響因子:6.7/Q1
發(fā)表時間:2024年11月22日
研究背景:子宮老化是導(dǎo)致老年女性生育能力下降的關(guān)鍵因素,也與月經(jīng)失調(diào)、子宮內(nèi)膜炎和子宮腺肌病有關(guān)。補腎健脾調(diào)血湯(BJTD)是一種中藥制劑,用于改善女性生殖系統(tǒng)的內(nèi)分泌失調(diào),并廣泛應(yīng)用于與衰老相關(guān)的子宮內(nèi)膜疾病。然而,其改善子宮衰老的機制尚未得到徹底研究。
研究思路:使用蘇木精和伊紅染色觀察形態(tài)學(xué)變化,使用Masson染色評估膠原蛋白沉積,并使用Western blot檢測凋亡相關(guān)分子。確定建模劑量后,以2次劑量進行BJTD干預(yù),并測量氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達。使用TUNEL檢測試劑盒和AnnexinV/FITC-PI檢測試劑盒評估細(xì)胞凋亡水平。通過UPLC-MS測定BJTD的主要成分,并使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探索BJTD作用的潛在靶點和機制。提取含BJTD的血清(BJTD-S)并使用人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(hESC) 進行體外實驗,以初步確定受影響的通路。
研究結(jié)果:
1、D-半乳糖誘導(dǎo)衰老激活子宮炎癥、膠原沉積和細(xì)胞凋亡
最初采用兩種建模方法,即頸部后連續(xù)皮下注射5周,分別使用200毫克/千克/天(D-Gal 200)和600毫克/千克/天(D-Gal 600)的劑量來誘導(dǎo)子宮衰老,以明確建模劑量(圖1A)。結(jié)果表明,兩種建模方法都降低了子宮指數(shù),但只有D-Gal 600建模導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)上顯著差異(圖1B)。此外,兩種建模方法都增加了子宮組織中TNF-α和IL-1β的水平,表明炎癥反應(yīng)的促進作用(圖1C-D)。HE染色結(jié)果顯示,用兩種劑量的D-Gal建模的小鼠表現(xiàn)出與衰老相關(guān)的相似形態(tài)學(xué)變化(圖1E)。Masson染色結(jié)果顯示,兩種劑量的D-Gal建模導(dǎo)致子宮組織膠原纖維沉積(圖1F)。Western blot結(jié)果顯示,兩種建模小鼠的衰老標(biāo)志物p53顯著增加。雖然相對于對照組,BCL-2水平下調(diào),BAX表達上調(diào),但僅在D-Gal 600模型中觀察到統(tǒng)計學(xué)意義上的差異(圖1G-J)。
圖1
2、BJTD改善D-Gal誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激
選擇D-Gal 600建模為基礎(chǔ),研究BJTD的功效(圖1A)。采用RT-qPCR檢測部分senescence-associated分泌表型(SASP)標(biāo)志物的mRNA水平(圖2A-B)。隨后,使用ELISA試劑盒檢測蛋白質(zhì)水平,表明BJTD干預(yù)可能通過post-transcriptional調(diào)控發(fā)揮其效果(圖2C-D)。D-Gal顯著降低SOD和GSH-Px的表達,以及T-AOC水平。兩種劑量的BJTD均顯著提高T-AOC,而只有BJTDH顯著提高SOD和GSH-Px水平。此外,D-Gal顯著增加MDA水平,BJTDH和BJTDL均顯著降低MDA水平(圖2E-H)。
圖2
3、BJTD抑制D-Gal誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中炎癥誘導(dǎo)激活的凋亡級聯(lián)信號
HE染色結(jié)果顯示,BITD部分減輕了D-Gal誘導(dǎo)的子宮形態(tài)損傷,減少了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞腫脹和基質(zhì)細(xì)胞空泡(圖3A)。TUNEL-POD染色顯示,兩種劑量的BJTD給藥均顯著減少了凋亡細(xì)胞的數(shù)量(圖3B)。COX-2和Caspase8的表達在組間沒有顯著差異(圖3C-J)。
圖3
4、BJTD-S抑制D-Gal誘導(dǎo)的hESCs細(xì)胞凋亡
使用hESCs進行了體外實驗,SA-β-gal染色顯示,持續(xù)24小時的200m MD-Gal干預(yù)增加了陽性細(xì)胞的數(shù)量,表明存在急性衰老(圖4A)。CCK-8結(jié)果顯示,白藜蘆醇在hESCs中的IC50為27.17μM;因此,干預(yù)濃度設(shè)置為13μM(圖4B)。在用兩種不同劑量的含藥物血清和白藜蘆醇干預(yù)后,D-Gal誘導(dǎo)的hESC細(xì)胞死亡受到抑制(圖4C-E)。白藜蘆醇能夠逆轉(zhuǎn)D-Gal誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,而只有高濃度的BJTD-S才能抑制氧化應(yīng)激損傷(圖4F-G)。細(xì)胞凋亡實驗表明,白藜蘆醇和BJTD-S均顯著降低了D-Gal誘導(dǎo)的hESC細(xì)胞凋亡的增加(圖4I)。
圖4
5、hESC衰老的差異基因表達和富集分析
對GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE160702數(shù)據(jù)集進行了分析,獲得70個DEGs(圖5A)。并進行了GO富集分析、GSEA分析,結(jié)果表明,分子功能富集的最重要條目是微管蛋白結(jié)合,而其他條目則不顯著,該基因集與細(xì)胞周期停滯、氧化磷酸化和DNA損傷修復(fù)有關(guān)(圖5B-D)。總之,對這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進一步分析揭示了與子宮基質(zhì)細(xì)胞衰老相關(guān)的基因以及與之相關(guān)的途徑。
圖5
6、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接揭示了SIRT1是BJTD改善子宮衰老的潛在靶點
根據(jù)UPLC-MS檢測(圖6)、文獻統(tǒng)計和數(shù)據(jù)庫預(yù)測,獲得了化合物的251個潛在靶標(biāo)和疾病121個潛在靶點(圖7A)。以往研究表明,SIRT1是這些靶點之一,從PDB數(shù)據(jù)庫下載了SIRT1的兩種構(gòu)型(4I5I和4ZZI)的結(jié)構(gòu),從PubChem獲得了acteoside、astragalin、formononetin、hyperin、narigenin、quercetin、tiliroside和trigoneline的3D結(jié)構(gòu)。預(yù)處理后,使用AutoDockVina進行分子對接,結(jié)果表明,具有SIRT1兩種構(gòu)型的每個分子的結(jié)合能均小于-5kcal/mol。其中,替利羅苷表現(xiàn)出the best的結(jié)合親和力,對4I5I的結(jié)合能為-10kcal/mol,對4ZZI的結(jié)合能為-10.3kcal/mol(圖7B)。具有兩種構(gòu)型的每個分子的the best結(jié)合位置如圖7C所示。
圖6
圖7
7、BJTD介導(dǎo)SIRT1/NRF2通路改善子宮的衰老
對對照組、D-Gal模型和BJTD-S干預(yù)組的hESCs進行NRF2和SIRT1的雙標(biāo)簽免疫熒光染色。結(jié)果表明,NRF2和SIRT1主要分布在hESCs的細(xì)胞質(zhì)中,建模后熒光表達降低,而BJTD干預(yù)增強了它們的表達(圖8A)。使用Western blot對蛋白質(zhì)表達進行定量,發(fā)現(xiàn)D-Gal建模后SIRT1和NRF2蛋白質(zhì)水平顯著降低,而BJTD顯著增加了它們的表達(圖8B-F)。再次對子宮組織切片進行NRF2和SIRT1的免疫染色,結(jié)果顯示,NRF2和SIRT1陽性細(xì)胞主要在基質(zhì)細(xì)胞中表達,D-Gal建模后數(shù)量明顯減少,而兩種劑量的BJTD均表現(xiàn)出NRF2和SIRT1陽性細(xì)胞增加的趨勢(圖8G)。子宮組織中HO-1-陽性細(xì)胞主要位于子宮內(nèi)膜基質(zhì),建模后數(shù)量明顯減少,但在BJTD-H干預(yù)后數(shù)量增加(圖8H)。蛋白質(zhì)定量結(jié)果顯示D-Gal干預(yù)后子宮組織中SIRT1、NRF2和HO-1表達顯著降低,僅BJTD-H顯著增加這三種蛋白質(zhì)的表達(圖8I-M)。
圖8
總結(jié):BJTD可以改善D-Gal誘導(dǎo)的子宮衰老中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平,其活性成分可以激活SIRT1/NRF2通路發(fā)揮其作用。重要的是,研究為傳統(tǒng)中醫(yī)影響子宮衰老的分子機制提供了新的見解。傲星生物深耕生信分析十余載,有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù),一對一專屬服務(wù)為您排憂解難,助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升!