題目：補腎健脾調(diào)血湯（BJTD）通過激活SIRT1/NRF2通路改善子宮衰老誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡

英文名：Bushen Jianpi Tiaoxue Decoction (BJTD) ameliorates oxidative stress and apoptosis induced by uterus ageing through activation of the SIRT1/NRF2 pathway

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發(fā)表時間：2024年11月22日

研究背景：子宮老化是導(dǎo)致老年女性生育能力下降的關(guān)鍵因素，也與月經(jīng)失調(diào)、子宮內(nèi)膜炎和子宮腺肌病有關(guān)。補腎健脾調(diào)血湯（BJTD）是一種中藥制劑，用于改善女性生殖系統(tǒng)的內(nèi)分泌失調(diào)，并廣泛應(yīng)用于與衰老相關(guān)的子宮內(nèi)膜疾病。然而，其改善子宮衰老的機制尚未得到徹底研究。

研究思路：使用蘇木精和伊紅染色觀察形態(tài)學(xué)變化，使用Masson染色評估膠原蛋白沉積，并使用Western blot檢測凋亡相關(guān)分子。確定建模劑量后，以2次劑量進行BJTD干預(yù)，并測量氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達。使用TUNEL檢測試劑盒和AnnexinV/FITC-PI檢測試劑盒評估細(xì)胞凋亡水平。通過UPLC-MS測定BJTD的主要成分，并使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探索BJTD作用的潛在靶點和機制。提取含BJTD的血清（BJTD-S）并使用人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（hESC） 進行體外實驗，以初步確定受影響的通路。

研究結(jié)果：

1、D-半乳糖誘導(dǎo)衰老激活子宮炎癥、膠原沉積和細(xì)胞凋亡

最初采用兩種建模方法，即頸部后連續(xù)皮下注射5周，分別使用200毫克/千克/天（D-Gal 200）和600毫克/千克/天（D-Gal 600）的劑量來誘導(dǎo)子宮衰老，以明確建模劑量（圖1A）。結(jié)果表明，兩種建模方法都降低了子宮指數(shù)，但只有D-Gal 600建模導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)上顯著差異（圖1B）。此外，兩種建模方法都增加了子宮組織中TNF-α和IL-1β的水平，表明炎癥反應(yīng)的促進作用（圖1C-D）。HE染色結(jié)果顯示，用兩種劑量的D-Gal建模的小鼠表現(xiàn)出與衰老相關(guān)的相似形態(tài)學(xué)變化（圖1E）。Masson染色結(jié)果顯示，兩種劑量的D-Gal建模導(dǎo)致子宮組織膠原纖維沉積（圖1F）。Western blot結(jié)果顯示，兩種建模小鼠的衰老標(biāo)志物p53顯著增加。雖然相對于對照組，BCL-2水平下調(diào)，BAX表達上調(diào)，但僅在D-Gal 600模型中觀察到統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（圖1G-J）。

圖1

2、BJTD改善D-Gal誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激

選擇D-Gal 600建模為基礎(chǔ)，研究BJTD的功效（圖1A）。采用RT-qPCR檢測部分senescence-associated分泌表型（SASP）標(biāo)志物的mRNA水平（圖2A-B）。隨后，使用ELISA試劑盒檢測蛋白質(zhì)水平，表明BJTD干預(yù)可能通過post-transcriptional調(diào)控發(fā)揮其效果（圖2C-D）。D-Gal顯著降低SOD和GSH-Px的表達，以及T-AOC水平。兩種劑量的BJTD均顯著提高T-AOC，而只有BJTDH顯著提高SOD和GSH-Px水平。此外，D-Gal顯著增加MDA水平，BJTDH和BJTDL均顯著降低MDA水平（圖2E-H）。

圖2

3、BJTD抑制D-Gal誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中炎癥誘導(dǎo)激活的凋亡級聯(lián)信號

HE染色結(jié)果顯示，BITD部分減輕了D-Gal誘導(dǎo)的子宮形態(tài)損傷，減少了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞腫脹和基質(zhì)細(xì)胞空泡（圖3A）。TUNEL-POD染色顯示，兩種劑量的BJTD給藥均顯著減少了凋亡細(xì)胞的數(shù)量（圖3B）。COX-2和Caspase8的表達在組間沒有顯著差異（圖3C-J）。

圖3

4、BJTD-S抑制D-Gal誘導(dǎo)的hESCs細(xì)胞凋亡

使用hESCs進行了體外實驗，SA-β-gal染色顯示，持續(xù)24小時的200m MD-Gal干預(yù)增加了陽性細(xì)胞的數(shù)量，表明存在急性衰老（圖4A）。CCK-8結(jié)果顯示，白藜蘆醇在hESCs中的IC50為27.17μM;因此，干預(yù)濃度設(shè)置為13μM（圖4B）。在用兩種不同劑量的含藥物血清和白藜蘆醇干預(yù)后，D-Gal誘導(dǎo)的hESC細(xì)胞死亡受到抑制（圖4C-E）。白藜蘆醇能夠逆轉(zhuǎn)D-Gal誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，而只有高濃度的BJTD-S才能抑制氧化應(yīng)激損傷（圖4F-G）。細(xì)胞凋亡實驗表明，白藜蘆醇和BJTD-S均顯著降低了D-Gal誘導(dǎo)的hESC細(xì)胞凋亡的增加（圖4I）。

圖4

5、hESC衰老的差異基因表達和富集分析

對GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE160702數(shù)據(jù)集進行了分析，獲得70個DEGs（圖5A）。并進行了GO富集分析、GSEA分析，結(jié)果表明，分子功能富集的最重要條目是微管蛋白結(jié)合，而其他條目則不顯著，該基因集與細(xì)胞周期停滯、氧化磷酸化和DNA損傷修復(fù)有關(guān)（圖5B-D）。總之，對這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進一步分析揭示了與子宮基質(zhì)細(xì)胞衰老相關(guān)的基因以及與之相關(guān)的途徑。

圖5

6、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接揭示了SIRT1是BJTD改善子宮衰老的潛在靶點

根據(jù)UPLC-MS檢測（圖6）、文獻統(tǒng)計和數(shù)據(jù)庫預(yù)測，獲得了化合物的251個潛在靶標(biāo)和疾病121個潛在靶點（圖7A）。以往研究表明，SIRT1是這些靶點之一，從PDB數(shù)據(jù)庫下載了SIRT1的兩種構(gòu)型（4I5I和4ZZI）的結(jié)構(gòu)，從PubChem獲得了acteoside、astragalin、formononetin、hyperin、narigenin、quercetin、tiliroside和trigoneline的3D結(jié)構(gòu)。預(yù)處理后，使用AutoDockVina進行分子對接，結(jié)果表明，具有SIRT1兩種構(gòu)型的每個分子的結(jié)合能均小于-5kcal/mol。其中，替利羅苷表現(xiàn)出the best的結(jié)合親和力，對4I5I的結(jié)合能為-10kcal/mol，對4ZZI的結(jié)合能為-10.3kcal/mol（圖7B）。具有兩種構(gòu)型的每個分子的the best結(jié)合位置如圖7C所示。

圖6

圖7

7、BJTD介導(dǎo)SIRT1/NRF2通路改善子宮的衰老

對對照組、D-Gal模型和BJTD-S干預(yù)組的hESCs進行NRF2和SIRT1的雙標(biāo)簽免疫熒光染色。結(jié)果表明，NRF2和SIRT1主要分布在hESCs的細(xì)胞質(zhì)中，建模后熒光表達降低，而BJTD干預(yù)增強了它們的表達（圖8A）。使用Western blot對蛋白質(zhì)表達進行定量，發(fā)現(xiàn)D-Gal建模后SIRT1和NRF2蛋白質(zhì)水平顯著降低，而BJTD顯著增加了它們的表達（圖8B-F）。再次對子宮組織切片進行NRF2和SIRT1的免疫染色，結(jié)果顯示，NRF2和SIRT1陽性細(xì)胞主要在基質(zhì)細(xì)胞中表達，D-Gal建模后數(shù)量明顯減少，而兩種劑量的BJTD均表現(xiàn)出NRF2和SIRT1陽性細(xì)胞增加的趨勢（圖8G）。子宮組織中HO-1-陽性細(xì)胞主要位于子宮內(nèi)膜基質(zhì)，建模后數(shù)量明顯減少，但在BJTD-H干預(yù)后數(shù)量增加（圖8H）。蛋白質(zhì)定量結(jié)果顯示D-Gal干預(yù)后子宮組織中SIRT1、NRF2和HO-1表達顯著降低，僅BJTD-H顯著增加這三種蛋白質(zhì)的表達（圖8I-M）。

圖8

總結(jié)：BJTD可以改善D-Gal誘導(dǎo)的子宮衰老中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平，其活性成分可以激活SIRT1/NRF2通路發(fā)揮其作用。重要的是，研究為傳統(tǒng)中醫(yī)影響子宮衰老的分子機制提供了新的見解。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！