題目：整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法揭示雌馬酚通過調(diào)控HCT116細(xì)胞中多細(xì)胞周期基因抑制結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

英文名：Integrated network pharmacology and transcriptomic approach reveal the role of Equol in reducing colorectal cancer via regulating multiple cell cycle genes in HCT116 cells

雜志：Macromolecules

影響因子：7.7/Q1

發(fā)表時間：2024年10月24日

研究背景：結(jié)直腸癌是一種癌癥，通常以結(jié)腸和直腸上皮組織中的良性腫瘤開始。結(jié)直腸癌是世界上第三大最常見的惡性腫瘤，也是第二大最常見的癌癥死亡原因。雌馬酚是一種異黃酮衍生的代謝物，已知表現(xiàn)出強(qiáng)烈的雌激素和抗氧化活性。盡管雌馬酚具有眾所周知的抗癌潛力，但其潛在機(jī)制仍然未知。

研究思路：通過CCK-8、劃痕愈合和集落形成實驗，分析了雌馬酚對癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。然后，利用RNA-seq分析探究雌馬酚抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的調(diào)控通路。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選核心基因，隨后，采用Western blot方法檢測關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，最后，進(jìn)行分子對接分析，從分子水平揭示雌馬酚與靶蛋白的相互作用。研究表明，雌馬酚可以通過靶向多種途徑抑制結(jié)直腸癌，暗示其作為結(jié)直腸癌輔助治療的關(guān)鍵組成部分的潛力。

1、雌馬酚抑制細(xì)胞增殖、遷移和集落形成

雌馬酚以劑量和時間依賴性的方式抑制四種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（HCT116、HT29、SW480和Caco2細(xì)胞）的增殖（圖1a）。濃度≥40μg/mL和80μg/mL的雌馬酚在孵育24小時后分別抑制HCT116和HT29細(xì)胞的遷移（圖1b）。與對照組相比，當(dāng)使用20μg/mL雌馬酚時，HCT116和HT29細(xì)胞的集落形成能力明顯受到抑制，而當(dāng)使用40μg/mL雌馬酚時，僅觀察到可忽略不計的集落形成（圖1c）。這些結(jié)果表明，雌馬酚可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和集落形成，HCT116細(xì)胞因其對雌馬酚的高度敏感性而被選擇用于進(jìn)一步的實驗。

圖1

2、 雌馬酚誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)用于評估雌馬酚是否能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。圖2a顯示了HCT116細(xì)胞群的不同階段。此外，雌馬酚干預(yù)后G2/M期細(xì)胞的比例增加，但未顯著增加。細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖 2b所示，細(xì)胞凋亡率與雌馬酚劑量呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，雌馬酚可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并以劑量依賴性方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖2

3、雌馬酚在HCT116細(xì)胞中誘導(dǎo)獨特的基因表達(dá)模式

對照組（CK）和馬肝酚處理組（EQ）的基因如維恩圖所示（圖3a），在CK和EQ組中分別檢測到14,910和14,812個基因，在EQ和CK組之間鑒定了1685個DEGs（圖3b）。根據(jù)PCA分?jǐn)?shù)圖（圖3c），樣本沿第一主成分（PC1）明確分為兩組，占方差的84.87%。因此，很明顯雌馬酚處理的癌細(xì)胞（HCT116細(xì)胞）改變了基因表達(dá)。差異表達(dá)基因的分層聚類和熱圖分析如圖 3d所示。熱圖中可見的不同模式表明，雌馬酚處理會誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的顯著變化。這一觀察結(jié)果有力地支持了我們的假設(shè)，即雌馬酚對結(jié)直腸癌細(xì)胞的基因表達(dá)模式有重大影響。

圖3

4、差異表達(dá)基因的GO和KEGG通路富集分析

DEGs的GO術(shù)語富集分析顯示，與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)的GO術(shù)語顯著富集，例如細(xì)胞器裂變、核分裂、DNA復(fù)制、染色體分離、有絲分裂細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和有絲分裂核分裂。對于用雌馬酚處理的細(xì)胞，與所有DEGs相關(guān)的KEGG通路與谷氨酸能突觸、HIF-1信號通路、DNA復(fù)制和細(xì)胞周期有關(guān)。

5、樞紐基因篩選和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

從GeneCards數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，獲得了168個目標(biāo)基因（圖4a）。PPI分析了來自168個候選基因的112個基因，其中包括112個節(jié)點和310個邊緣（圖4b）。Cytoscape分析如圖 4c所示。共有17個具有maximum團(tuán)中心性（MCC）的基因被選為候選基因（圖 4d）。17個樞紐基因之間的相互作用如圖4e所示。TF基因靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如圖 4g所示，2個TFs在對癌細(xì)胞進(jìn)行雌馬酚處理后下調(diào)（圖 4h）。Western blot實驗表明，癌細(xì)胞接受80μg/mL的馬其酚后，CDK1、CCNA2、CCND1、E2F1和NFYA的表達(dá)降低，而CCNB1的表達(dá)在接受40μg/mL的雌馬酚后表達(dá)降低（圖 4i）。

圖4

總結(jié)：本文利用了轉(zhuǎn)錄組測序巧妙的結(jié)合了網(wǎng)藥分析，揭示了雌馬酚發(fā)揮其抗癌作用的潛在機(jī)制之一是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！