題目：整合代謝組學和網絡藥理學揭示麝香保心丸抗動脈粥樣硬化的作用機制

英文名：Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of Shexiang Baoxin pill against atherosclerosis

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發(fā)表時間：2024年10月11日

研究背景：動脈粥樣硬化是一種以血管內皮發(fā)生脂質病變?yōu)樘卣鞯募膊?，仍然是導致全球死亡的一個主要因素。麝香保心丸（SBP）已被用于治療多種心血管疾病，但其復雜的作用機制仍不清楚。本研究旨在確定射香保心丸對動脈粥樣硬化的潛在影響以及相關的潛在調控機制。

研究思路：利用網絡藥理學預測藥物-疾病的關鍵靶點，并應用非靶點代謝組學分析鑒定關鍵代謝物和代謝途徑。構建小鼠動脈粥樣硬化模型以明確SBP對動脈粥樣硬化的保護作用，并進行體內和體外試驗以驗證分析結果和明確SBP影響動脈粥樣硬化的機制。結果顯示結果表明，SBP在體內可通過降低血脂水平、斑塊形成和內皮損傷發(fā)揮保護作用。網絡藥理學和代謝組學顯示，MAPK3、AKT1和STAT3是樞紐靶點，三甲胺正氧化物（TMAO）是關鍵代謝物。由于TMAO具有致動脈粥樣硬化的作用，因此研究人員在體外研究了SBP的相應保護作用。SBP抑制了TMAO誘導的內皮細胞凋亡和氧化應激，并抵消了MAPK3、AKT1和STAT3表達的上調。分子對接和酶抑制作用表明，SBP的活性成分能與關鍵靶蛋白穩(wěn)定結合。

研究結果：

1、網絡藥理學分析

通過SwissADME和SwissTargetPrediction的篩選和預測，共發(fā)現了861個藥物靶點，其中成分與靶點之間的對應關系如圖1A所示。在至少兩個數據庫中篩選后，確定了843個動脈粥樣硬化的疾病靶點（圖1B）。藥物與疾病靶點相互作用的維恩圖見圖1C。GO分析顯示，CC項涉及膜筏和局灶粘附，MF項涉及核受體和內肽酶活性（圖1D）。根據KEGG分析結果，脂質和動脈粥樣硬化、細胞凋亡、PI3K-Akt和IL-17信號通路被強烈富集（圖1E）。

接下來，作者構建了PPI網絡并篩選出了中心基因（圖1F）。圖1G中顯示了33個相關的TFs，其中關聯度highest的是FOXC1、GATA2、YY1、HINFP、USF2、MAX和TFAP2A。在如圖1H所示，基因-miRNA網絡由與樞紐基因高度相關的miRNAs發(fā)揮作用：hsa-mir-19a-3p、hsa-mir-17-5p、hsa-mir-19b-3p、hsa-mir-20a-5p。上述中樞基因、TFs和miRNA可能在動脈粥樣硬化中具有潛在的作用，隨后進行了一系列實驗來驗證預測結果。

圖1

2、SBP對血脂水平和動脈粥樣硬化病變的影響

    在整個實驗過程中，每三周記錄一次體重。在每組之間觀察到沒有統(tǒng)計學上的顯著差異，這表明SBP不會干擾小鼠的食欲或能量消耗。與模型組相比，治療組在SBP灌飼12周后TC、TG和LDL-C水平顯著降低（圖2A-C）。此外，ALT、AST和Urea水平在組間無顯著差異，表明SBP對小鼠的肝或腎功能沒有影響（圖2D-F）。

圖2

 在組織病理學方面，最初通過量化主動脈斑塊病變的尺寸來檢查SBP對AS的影響。在模型組中，反映主動脈粥樣硬化程度的油紅O染色區(qū)域的百分比遠高于對照組，而SBP抑制了這種變化（圖3A）。此外，主動脈根部病變面積和膠原蛋白含量與H&E和Masson染色也是評估AS的關鍵指標，顯示SBP表現出病變面積和膠原蛋白含量增加的顯著逆轉（圖3B-C）。因此，這些結果表明SBP通過減少脂質積累和抑制主動脈斑塊形成來改善AS。

圖3

3、潛在的差異代謝物篩選和通路富集

為了研究SBP對動脈粥樣硬化的代謝影響，對小鼠血清樣本進行了代謝組學測定和分析。PCA是一種降尺度數據分析方法，它將最初鑒定出的代謝物進行線性重組，形成一個新的復合變量。在對照組、AS組和SBP組中，組間分離明顯，組內聚集嚴重（圖4A）。評價參數R2X、R2Y和Q2表明OPLS-DA具有良好的魯棒性，不會出現過度擬合現象（圖4B-C），因此適用于代謝物和通路分析。

圖4

為便于后續(xù)分析，兩個SBP劑量的數據合并為一組。對比對照組和AS組，得到了39個不同的代謝物。同樣，AS組和SBP組也得到了64個不同的代謝物。這兩種情況的交集產生了32個差異代謝物，它們是本研究的關鍵代謝物(圖5a-C）。此外，還發(fā)現了七條代謝途徑，包括亞油酸代謝、類固醇激素生物合成、肌醇磷酸代謝、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、類固醇生物合成和初級膽汁酸生物合成（圖5D-F）。根據代謝組學分析，作者確定了可能影響動脈粥樣硬化治療過程中代謝狀態(tài)的4種代謝物和SBP對經TMAO處理的HUVEC的遷移、凋亡和氧化應激的影響7條代謝途徑。

圖5

4、SBP對TMAO處理的HUVECs遷移、凋亡和氧化應激的影響

對初始組和劃痕后24小時處理組的傷口面積進行了量化和比較，結果表明TMAO抑制了細胞遷移，而相反地在SBP組中觀察到細胞遷移模式。這一發(fā)現表明，在刺激條件下，SBP與TMAO一樣能抵消對細胞遷移的抑制（圖6A-B）。研究表明，內皮細胞凋亡與ROS的產生密切相關。為了揭示TMAO和SBP對內皮細胞凋亡的影響，使用了流式細胞術。根據圖5C中紅色部分顯示，TMAO增加了早期和晚期凋亡細胞的比例。服用SBP后，凋亡細胞的比例下降，表明SBP抑制了TMAO誘導的細胞凋亡（圖6C-D）。此外，由于氧化應激是導致動脈粥樣硬化惡化的重要因素，研究了SBP是否參與了細胞內ROS的清除。TMAO明顯增加了HUVECs中的ROS水平，而SBP阻止了這些變化并降低了內皮氧化應激（圖6E-F）。這些結果表明，SBP可抑制TMAO誘導的HUVEC細胞凋亡和氧化應激，并減輕TMAO對細胞遷移的抑制作用。

圖6

5、SBP可減輕體內和體外的內皮功能障礙

內皮功能障礙已被確定為誘發(fā)動脈粥樣硬化的起始因素之一，而VCAM-1和ICAM-1的表達對于內皮功能障礙的調節(jié)至關重。研究SBP對內皮損傷調控的體內影響是通過免疫組化實驗進行的。在模型中，VCAM-1和ICAM-1的水平顯著升高。而SBP可抑制它們的表達（圖7A-D）。在體外，發(fā)現TMAO增加了HUVEC中ICAM-1和VCAM-1的表達，相反，SBP組的ICAM-1和VCAM-1表達明顯降低，這表明SBP在體外參與了對TMAO誘導的內皮損傷的保護。此外，LOX-1也是內皮功能障礙的指標之一，觀察了它在TMAO和SBP作用下是否與ICMA-1有相同的趨勢。TMAO可誘導HUVEC中LOX-1的表達上調，而SBP可抑制LOX-1的表達（圖7E-H）。因此，研究結果表明，SBP可降低主動脈根部和HUVEC中LOX-1、ICAM-1和VCAM-1的表達，反映了SBP通過緩解內皮功能障礙對AS具有保護作用。

圖7

6、通過減少MAPK3、AKT1和STAT3的表達，SBP可改善動脈粥樣硬化的病情

通過結合初步的網絡藥理學和代謝組學研究，作者預測MAPK3、AKT1和STAT3是SBP參與AS調控的關鍵靶標；接下來試圖在體內和體外驗證這些結果，對MAPK3的免疫組化分析表明，模型組中MAPK3表達上調，而SBP中表達下調（圖8A-B）。對各組小鼠采集的主動脈組織進行的Western印跡分析表明，SBP逆轉了磷酸化(P)-MAPK3、P-AKT1和P-STAT3表達增加的趨勢（圖8C-F）。此外，體外實驗表明，TMAO上調了HUVEC中P-MAPK3、P-AKT1和P-STAT3的表達，而SBP則降低了這些基因的表達（圖8G-J）。簡而言之，這些結果提供了SBP通過調節(jié)MAPK3、AKT1和STAT3緩解動脈粥樣硬化的證據。

圖8

7、分子對接

為了研究SBP有效成分與核心靶點之間的相互作用，進行了分子對接分析，選擇了山奈酚、N-核苷酸和麥角胺作為配體，并根據配體與靶點網絡的程度選擇了山奈酚和麥角胺作為配體。選擇MAPK3、STAT3和AKT1作為受體，它們的the best結合模式和親和力如圖9所示。根據分子對接的結果，本研究中評估的三種SBP成分能夠與確定的三個靶點形成穩(wěn)定的相互作用。

圖9

8、酶抑制作用

為了驗證分子對接的準確性，通過酶抑制實驗檢測了山奈酚、N-核苷酸和麥角胺對MAPK3、STAT3和AKT1的抑制作用。山奈酚、N-核苷酸和麥角胺對MAPK1的抑制率分別為（68.52±±0.40）%、（63.07±±0.45）%和（72.04±±0.07）%、圖10A）；對STAT3的抑制率分別為（59.84±±0.51)%、(60.84±±0.70)%和(61.84±±0.59)%（圖10B）。AKT1為(63.48±±0.45)%，(66.87±±0.47)%，(74.09±±0.45)%。0.49）%（圖10C）。以上結果均大于50%，其中麥角胺對AKT1的抑制作用最強，這與分子對接結果一致?？傊敢种茖嶒灡砻?，這三種化合物對AKT1的抑制作用均在50%以上（圖10C）。對這三種蛋白質的抑制作用，并在體外驗證了分子對接的準確性。

圖10

總結：本文的思路很完整，網絡藥理學+代謝組學的綜合研究，并進行了驗證，為SBP通過介導腸道-心臟軸參與心血管保護提供了新的見解！傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗證、機制研究服務，一對一專屬服務為您排憂解難，助您輕松應對畢業(yè)和晉升！