題目：低水平暴露于BDE-47會通過TOP2A/LDHA/乳酸化正反饋回路促進前列腺癌的發(fā)展

英文名：Low level exposure to BDE-47 facilitates the development of prostate cancer through TOP2A/LDHA/lactylation positive feedback circuit

雜志：Environmental Research

影響因子：7.7

發(fā)表時間：2024年10月

研究背景：2,2′，4,4′-四溴化二苯醚（BDE-47）是一種阻燃劑，有半揮發(fā)性、高毒性、生物累積性，是一種有機污染物（POPs）。雖然BDE-47與激素依賴性癌癥（如乳腺癌）的關(guān)系已得到證實，但之前的研究并未考察BDE-47暴露是否與前列腺癌（PCa）的發(fā)生有關(guān)。本研究旨在通過大量和單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析以及體外和體內(nèi)實驗，研究BDE-47暴露對PCa進展的影響。

研究思路：基于比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD）和癌癥基因組圖譜（TCGA），通過篩選和重疊獲得了34個BDE-47相關(guān)基因和PCa相關(guān)基因。這些基因明顯富集在脂肪酸代謝相關(guān)的GO通路中，從UniProt獲得的BDE-47靶向基因中也在這些術(shù)語富集。通過scRNA-seq數(shù)據(jù)，在男性PCa組織中觀察到CYP2E1、PIK3R1、FGF2和TOP2A有一定的細胞類型特異性表達。分子對接模擬顯示，BDE-47與AOXI、PIK3R1、FGF2、CAV2、CYP2E1和TOP2A的蛋白殘基緊密結(jié)合。根據(jù)患者總生存率、接收者操作特征曲線（ROC）和格里森評分分級系統(tǒng)進行進一步篩選后，候選基因的范圍縮小到了TOP2A。從機理上講，TOP2A抑制劑可以逆轉(zhuǎn)BDE-47對PCa細胞的生長促進作用。隨后的RNA-seq實驗表明，TOP2A通過上調(diào)LDHA和糖酵解促進了PCa的進展。此外，乳酸通過乳化PCa細胞中的H3K18la上調(diào)了TOP2A的轉(zhuǎn)錄，而LDHA的敲除可以挽救這種情況。綜上所述，低劑量BDE-47通過TOP2A/LDHA/乳酸化正反饋回路觸發(fā)PCa進展，從而揭示了BDE-47誘導(dǎo)前列腺癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)轉(zhuǎn)變和代謝重編程的基礎(chǔ)。

研究結(jié)果：

1、低劑量BDE-47可誘發(fā)體外和體內(nèi)PCa的進展

首先，應(yīng)用CCK-8試驗評估BDE-47對細胞的毒性。PCa細胞（PC3和LNCaP）暴露于BDE-47（0-10pM）。給予BDE-47后，分別在4、8、12或24小時后評估細胞存活率。結(jié)果表明，BDE-47的濃度為0、0.01、0.1或1pM時，細胞活力均無明顯變化。另一方面，當(dāng)濃度為10pM時，PCa細胞的活力開始顯著下降。考慮到BDE-47的細胞毒性和人體暴露情況，選擇了低劑量（0.01和0.1qM）進行進一步實驗，探討了低劑量（0.01和0.1qM）BDE-47對PC3和LNCaP細胞生長的影響。一系列體外實驗表明，低劑量BDE-47以劑量依賴的方式促進了PC3和LNCaP細胞的增殖（圖1A-C）、遷移（圖1D-G）和侵襲（圖1H-I）。隨后，還在體內(nèi)研究了低劑量BDE-47對PCa細胞的影響。發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BDE-47組的腫瘤重量呈明顯的劑量依賴性增加趨勢（圖1J-K）。此外，還通過H&E染色對腫瘤組織學(xué)進行了評估。在所有三個組中，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中，細胞核與細胞質(zhì)的比率無一例外地相對較高。與對照組的腫瘤組織形態(tài)相比，BDE-47組中檢測到更多的空泡和核染色過深的細胞（圖IL）。上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是癌癥進展過程中的一個關(guān)鍵事件。上皮和間質(zhì)標記是EMT的標志，對小鼠腫瘤組織的IHC染色顯示，間質(zhì)標記物（N-cadherin和波形蛋白）的表達水平與BDE-47劑量呈正相關(guān)（圖1L-M）。相反，檢測到上皮標志物（E-cadherin）的表達水平與BDE-47劑量呈負相關(guān)（圖1L-M）。這可以解釋為BDE-47會引發(fā)PCa細胞在體內(nèi)的進展。

圖1

2、PCa相關(guān)基因和BDE-47相關(guān)基因的鑒定和富集

基于TCGA的正常前列腺和PCa組織樣本，進行了差異基因表達分析，得到了正常前列腺和PCa樣本之間的2983個DEGs。在這些DEGs中，1270個上調(diào)，1713個下調(diào)（圖2A）。然后將這些DEGs與CTD數(shù)據(jù)庫中的BDE-47相關(guān)基因和PCa相關(guān)基因進行交叉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了34個重疊基因（圖2B）。根據(jù)這些重疊基因，進行了GO和KEGG注釋（圖2C-D）。GO富集的結(jié)果包括脂肪酸代謝、激素分解代謝過程、對氧化應(yīng)激的響應(yīng)等通路（圖2C），KEGG通路包括類固醇激素合成和許多化療藥抗性相關(guān)通路（圖2D-E）。此外，有29個重疊基因被用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含140條邊（圖2F）。在這29個重疊基因中，UGT2B15、MMP9、FOLH1、EPCAM、HSD17B3、TOP2A、GDF15、AMACR和GNMT上調(diào)，而其他20個基因下調(diào)（圖2F）

圖2

3、篩選PCa的預(yù)后相關(guān)基因和診斷相關(guān)基因

為了探討PCa組織中基因表達與總生存率的相關(guān)性，從TCGA中提取了重疊基因的mRNA水平和PRAD病例的臨床信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個重疊基因在低表達和高表達的PCa病例之間的總生存率存在顯著差異，包括AOX1（圖3A）、CAV2（圖3B）、CYP2E1(圖3C）、FGF2（圖3D）、LRP1B（圖3E）、GJA1（圖3F）、LPL（圖3G）、HSD17B3（圖3H）、TOP2A（圖3I）、MET（圖3J）、PIK3R1（圖3K）和SULTIEl（圖3L）。

圖3

根據(jù)TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的正常前列腺和PCa樣本，利用ROC曲線進一步評估了各重疊基因在PCa中的診斷價值。結(jié)果顯示，AOX1（圖4A）、FGF2（圖4B）、CAV2（圖4C）、CYP2E1（圖4D）、TOP2A（圖4E）、LRPIB（圖4F）和PIK3R1（圖4G）等7個基因的AUC均超過0.8，具有很好或突出的診斷價值。

圖4

4、分子對接和藥物靶點分析

為了預(yù)測BDE-47的結(jié)合位點和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進行了分子對接。經(jīng)過這一篩選步驟后，還剩下6個基因。對接結(jié)果顯示，AOX1、PIK3R1、FGF2、CAV2、CYP2E1和TOP2A的對接得分相對較高，BDE-47通過H鍵與這些蛋白殘基緊密結(jié)合（圖5a-F）。此外，還通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲得了BDE-47的277個靶基因，并進行了GO術(shù)語富集，富集結(jié)果主要包括脂肪酸β-氧化、脂肪酰-CoA結(jié)合和其他脂肪酸代謝相關(guān)通路（圖5G），這意味著BDE-47可能在很大程度上影響了PCa的脂肪酸代謝。

圖5

5、前列腺不同細胞類型中基因的表達分布

為了探索其余6個基因在前列腺內(nèi)不同細胞類型中的表達分布，通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù)，注釋了前列腺組織樣本中的11種細胞類型（圖6A），每個marker基因都表現(xiàn)出相應(yīng)細胞類型特異性的高表達（圖6B）。正常前列腺組織樣本和PCa組織樣本的整體基因表達分布存在明顯差異（圖6C）。在不同細胞類型中，基底上皮（BE）和管腔上皮（LE）的細胞數(shù)量比例highest（圖6D）。與正常前列腺樣本相比，PCa樣本中LE的細胞數(shù)比例較高，而BE的細胞數(shù)比例較低（圖6E）。此外，還研究了其余6個基因在正常前列腺樣本和PCa樣本中的表達分布，觀察發(fā)現(xiàn)，CYP2E1在正常前列腺和PCa樣本中具有高度特異性表達（圖6F）。

圖6

6、低劑量BDE-47通過上調(diào)TOP2A促進PCa的進展

為了研究基因表達水平與PCa組織Gleason評分的相關(guān)性，比較了18例Gleason評分為≤6的PCa樣本和47例Gleason評分為≥7的PCa樣本中其余6個基因的表達水平。TOP2A在Gleason評分為≥7的PCa樣本中的表達水平明顯高于Gleason評分為≤6的樣本（圖7A）。相比之下，其他5個基因的表達水平在Gleason評分≥7分的PCa樣本和Gleason評分≤6分的PCa樣本中沒有明顯差異。此外，在PC3和LNCaP細胞中檢測到的TOP2A蛋白水平明顯高于WPMY-1細胞（圖7B）。為了研究TOP2A表達對PCa細胞進展的影響，用低劑量（0.01pM）BDE-47處理PC3或LNCaP細胞，同時使用/不使用TOP2A抑制劑ICRF-193。事實證明，低劑量BDE-47能上調(diào)PC3和LNCaP細胞的增殖，而TOP2A抑制劑ICRF-193則能挽救這種增殖（圖7C-E）。同樣，研究發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-47可促進PC3和LNCaP細胞的遷移能力（圖7F-I）和侵襲能力（圖7J和K），ICRF-193可緩解這種情況（圖7F-K）。

圖7

7、TOP2A可通過上調(diào)LDHA和糖酵解

為了研究TOP2A引發(fā)PCa進展的分子機制，分別將TOP2A siRNA轉(zhuǎn)染到PC3和LNCaP細胞中（圖8A）。對轉(zhuǎn)染了TOP2A siRNA的PC3細胞進行了RNA-Seq測序，富集分析顯示，TOP2A基因敲除對丙酮酸代謝、氧化磷酸化和癌癥中樞碳代謝有顯著影響（圖8B）。值得注意的是，丙酮酸代謝具有highest的富集指數(shù)（圖8B）。在丙酮酸代謝通路中的DEGs中，AKR1A1、ACOT12、LDHA、LDHC和ALDH7A1在TOP2A敲除后均表現(xiàn)出顯著且相似的下調(diào)（圖8C）。用qPCR驗證了TOP2A敲除對PCa細胞中AKRIAI、ACOT12、LDHA、LDHC和ALDH7A1mRNA水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TOP2A敲除后，PC3和LNCaP細胞中AKR1A1和LDHA的mRNA水平同時下調(diào)（圖8D）。此外，WB分析表明，TOP2A基因敲除后，PC3和LNCaP細胞中LDHA同時下調(diào)，而AIfR1A1沒有下調(diào)（圖8D-E)。此外，來自TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進一步證實了這一正向相關(guān)性。在PCa患者中，TOP2A和LDHA的mRNA水平之間存在差異（圖8F）。此外，低劑量（0.01uM）BDE-47可上調(diào)PC3細胞中LDHA的蛋白水平，而TOP2A基因敲除可挽救LDHA的蛋白水平（圖8G）。此外，TOP2A過表達也會上調(diào)PC3細胞中LDHA的蛋白水平（圖8G）。此外，還發(fā)現(xiàn)敲除TOP2A會降低LDH活性（圖8H）、葡萄糖攝取量（圖8I）和乳酸濃度（圖8J），這意味著敲除TOP2A對PCa細胞的糖酵解有抑制作用。

圖8

接下來研究了TOP2A和LDHA的表達對PCa進展的影響。具體而言，體外實驗表明，TOP2A敲除抑制了PC3和LNCaP細胞的增殖（圖9A-C）、遷移（圖9D-G）和侵襲（圖9H和I）能力，而LDHA的過表達則可以挽救這些能力（圖9A-I）。

圖9

8、乳酸鹽通過H3K18的乳化作用促進TOP2A的轉(zhuǎn)錄

為了評估PCa細胞的組蛋白乳化情況，用一系列濃度的LA處理PC3細胞。結(jié)果顯示，用LA處理后，PC3細胞中TOP2A、總?cè)榛≒an-Kla）和組蛋白乳化（H3K18la）的蛋白水平呈劑量依賴性上調(diào)（圖10A）。此外，LDHA基因敲除會降低TOP2A、Pan-Kla和H3K18la的蛋白水平，而LA處理可以挽救這些蛋白水平（圖10B）。考慮到組蛋白乳化會調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，研究了組蛋白乳化是否會影響TOP2A的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LDHA敲除抑制了PC3細胞中H3K18與TOP2A啟動子的結(jié)合活性，而用LA處理后這一效應(yīng)被挽救（圖10C）。此外，LDHA敲除會降低TOP2A的mRNA水平，LA處理后可逆轉(zhuǎn)（圖10D）。這些結(jié)果表明，LDHA或乳酸可通過組蛋白乳酸化上調(diào)TOP2A的轉(zhuǎn)錄。此外，研究還發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-47可通過上調(diào)TOP2A/LDHA通路促進PCa的進展（圖1-9）。基于上述證據(jù)，作者推斷低劑量BDE-47誘導(dǎo)了TOP2A/LDHA/乳酸化正反饋回路，從而進一步促進了PCa的進展。

圖10

總結(jié)：本文有很多熱點研究內(nèi)容，顯得很新穎，另外還做了細致的實驗，有力的分析了BDE-47暴露對前列腺癌發(fā)展的影響機制！傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！