Q1區(qū)7.7分,國自然熱點研究案例:網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)+分析對接+乳酸化+實驗機制解析?。?!
題目:低水平暴露于BDE-47會通過TOP2A/LDHA/乳酸化正反饋回路促進前列腺癌的發(fā)展
英文名:Low level exposure to BDE-47 facilitates the development of prostate cancer through TOP2A/LDHA/lactylation positive feedback circuit
雜志:Environmental Research
影響因子:7.7
發(fā)表時間:2024年10月
研究背景:2,2′,4,4′-四溴化二苯醚(BDE-47)是一種阻燃劑,有半揮發(fā)性、高毒性、生物累積性,是一種有機污染物(POPs)。雖然BDE-47與激素依賴性癌癥(如乳腺癌)的關(guān)系已得到證實,但之前的研究并未考察BDE-47暴露是否與前列腺癌(PCa)的發(fā)生有關(guān)。本研究旨在通過大量和單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析以及體外和體內(nèi)實驗,研究BDE-47暴露對PCa進展的影響。
研究思路:基于比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(CTD)和癌癥基因組圖譜(TCGA),通過篩選和重疊獲得了34個BDE-47相關(guān)基因和PCa相關(guān)基因。這些基因明顯富集在脂肪酸代謝相關(guān)的GO通路中,從UniProt獲得的BDE-47靶向基因中也在這些術(shù)語富集。通過scRNA-seq數(shù)據(jù),在男性PCa組織中觀察到CYP2E1、PIK3R1、FGF2和TOP2A有一定的細胞類型特異性表達。分子對接模擬顯示,BDE-47與AOXI、PIK3R1、FGF2、CAV2、CYP2E1和TOP2A的蛋白殘基緊密結(jié)合。根據(jù)患者總生存率、接收者操作特征曲線(ROC)和格里森評分分級系統(tǒng)進行進一步篩選后,候選基因的范圍縮小到了TOP2A。從機理上講,TOP2A抑制劑可以逆轉(zhuǎn)BDE-47對PCa細胞的生長促進作用。隨后的RNA-seq實驗表明,TOP2A通過上調(diào)LDHA和糖酵解促進了PCa的進展。此外,乳酸通過乳化PCa細胞中的H3K18la上調(diào)了TOP2A的轉(zhuǎn)錄,而LDHA的敲除可以挽救這種情況。綜上所述,低劑量BDE-47通過TOP2A/LDHA/乳酸化正反饋回路觸發(fā)PCa進展,從而揭示了BDE-47誘導(dǎo)前列腺癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)轉(zhuǎn)變和代謝重編程的基礎(chǔ)。
研究結(jié)果:
1、低劑量BDE-47可誘發(fā)體外和體內(nèi)PCa的進展
首先,應(yīng)用CCK-8試驗評估BDE-47對細胞的毒性。PCa細胞(PC3和LNCaP)暴露于BDE-47(0-10pM)。給予BDE-47后,分別在4、8、12或24小時后評估細胞存活率。結(jié)果表明,BDE-47的濃度為0、0.01、0.1或1pM時,細胞活力均無明顯變化。另一方面,當(dāng)濃度為10pM時,PCa細胞的活力開始顯著下降。考慮到BDE-47的細胞毒性和人體暴露情況,選擇了低劑量(0.01和0.1qM)進行進一步實驗,探討了低劑量(0.01和0.1qM)BDE-47對PC3和LNCaP細胞生長的影響。一系列體外實驗表明,低劑量BDE-47以劑量依賴的方式促進了PC3和LNCaP細胞的增殖(圖1A-C)、遷移(圖1D-G)和侵襲(圖1H-I)。隨后,還在體內(nèi)研究了低劑量BDE-47對PCa細胞的影響。發(fā)現(xiàn),與對照組相比,BDE-47組的腫瘤重量呈明顯的劑量依賴性增加趨勢(圖1J-K)。此外,還通過H&E染色對腫瘤組織學(xué)進行了評估。在所有三個組中,發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中,細胞核與細胞質(zhì)的比率無一例外地相對較高。與對照組的腫瘤組織形態(tài)相比,BDE-47組中檢測到更多的空泡和核染色過深的細胞(圖IL)。上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌癥進展過程中的一個關(guān)鍵事件。上皮和間質(zhì)標記是EMT的標志,對小鼠腫瘤組織的IHC染色顯示,間質(zhì)標記物(N-cadherin和波形蛋白)的表達水平與BDE-47劑量呈正相關(guān)(圖1L-M)。相反,檢測到上皮標志物(E-cadherin)的表達水平與BDE-47劑量呈負相關(guān)(圖1L-M)。這可以解釋為BDE-47會引發(fā)PCa細胞在體內(nèi)的進展。
圖1
2、PCa相關(guān)基因和BDE-47相關(guān)基因的鑒定和富集
基于TCGA的正常前列腺和PCa組織樣本,進行了差異基因表達分析,得到了正常前列腺和PCa樣本之間的2983個DEGs。在這些DEGs中,1270個上調(diào),1713個下調(diào)(圖2A)。然后將這些DEGs與CTD數(shù)據(jù)庫中的BDE-47相關(guān)基因和PCa相關(guān)基因進行交叉,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了34個重疊基因(圖2B)。根據(jù)這些重疊基因,進行了GO和KEGG注釋(圖2C-D)。GO富集的結(jié)果包括脂肪酸代謝、激素分解代謝過程、對氧化應(yīng)激的響應(yīng)等通路(圖2C),KEGG通路包括類固醇激素合成和許多化療藥抗性相關(guān)通路(圖2D-E)。此外,有29個重疊基因被用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)包含140條邊(圖2F)。在這29個重疊基因中,UGT2B15、MMP9、FOLH1、EPCAM、HSD17B3、TOP2A、GDF15、AMACR和GNMT上調(diào),而其他20個基因下調(diào)(圖2F)
圖2
3、篩選PCa的預(yù)后相關(guān)基因和診斷相關(guān)基因
為了探討PCa組織中基因表達與總生存率的相關(guān)性,從TCGA中提取了重疊基因的mRNA水平和PRAD病例的臨床信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn),12個重疊基因在低表達和高表達的PCa病例之間的總生存率存在顯著差異,包括AOX1(圖3A)、CAV2(圖3B)、CYP2E1(圖3C)、FGF2(圖3D)、LRP1B(圖3E)、GJA1(圖3F)、LPL(圖3G)、HSD17B3(圖3H)、TOP2A(圖3I)、MET(圖3J)、PIK3R1(圖3K)和SULTIEl(圖3L)。
圖3
根據(jù)TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的正常前列腺和PCa樣本,利用ROC曲線進一步評估了各重疊基因在PCa中的診斷價值。結(jié)果顯示,AOX1(圖4A)、FGF2(圖4B)、CAV2(圖4C)、CYP2E1(圖4D)、TOP2A(圖4E)、LRPIB(圖4F)和PIK3R1(圖4G)等7個基因的AUC均超過0.8,具有很好或突出的診斷價值。
圖4
4、分子對接和藥物靶點分析
為了預(yù)測BDE-47的結(jié)合位點和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),進行了分子對接。經(jīng)過這一篩選步驟后,還剩下6個基因。對接結(jié)果顯示,AOX1、PIK3R1、FGF2、CAV2、CYP2E1和TOP2A的對接得分相對較高,BDE-47通過H鍵與這些蛋白殘基緊密結(jié)合(圖5a-F)。此外,還通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲得了BDE-47的277個靶基因,并進行了GO術(shù)語富集,富集結(jié)果主要包括脂肪酸β-氧化、脂肪酰-CoA結(jié)合和其他脂肪酸代謝相關(guān)通路(圖5G),這意味著BDE-47可能在很大程度上影響了PCa的脂肪酸代謝。
圖5
5、前列腺不同細胞類型中基因的表達分布
為了探索其余6個基因在前列腺內(nèi)不同細胞類型中的表達分布,通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù),注釋了前列腺組織樣本中的11種細胞類型(圖6A),每個marker基因都表現(xiàn)出相應(yīng)細胞類型特異性的高表達(圖6B)。正常前列腺組織樣本和PCa組織樣本的整體基因表達分布存在明顯差異(圖6C)。在不同細胞類型中,基底上皮(BE)和管腔上皮(LE)的細胞數(shù)量比例highest(圖6D)。與正常前列腺樣本相比,PCa樣本中LE的細胞數(shù)比例較高,而BE的細胞數(shù)比例較低(圖6E)。此外,還研究了其余6個基因在正常前列腺樣本和PCa樣本中的表達分布,觀察發(fā)現(xiàn),CYP2E1在正常前列腺和PCa樣本中具有高度特異性表達(圖6F)。
圖6
6、低劑量BDE-47通過上調(diào)TOP2A促進PCa的進展
為了研究基因表達水平與PCa組織Gleason評分的相關(guān)性,比較了18例Gleason評分為≤6的PCa樣本和47例Gleason評分為≥7的PCa樣本中其余6個基因的表達水平。TOP2A在Gleason評分為≥7的PCa樣本中的表達水平明顯高于Gleason評分為≤6的樣本(圖7A)。相比之下,其他5個基因的表達水平在Gleason評分≥7分的PCa樣本和Gleason評分≤6分的PCa樣本中沒有明顯差異。此外,在PC3和LNCaP細胞中檢測到的TOP2A蛋白水平明顯高于WPMY-1細胞(圖7B)。為了研究TOP2A表達對PCa細胞進展的影響,用低劑量(0.01pM)BDE-47處理PC3或LNCaP細胞,同時使用/不使用TOP2A抑制劑ICRF-193。事實證明,低劑量BDE-47能上調(diào)PC3和LNCaP細胞的增殖,而TOP2A抑制劑ICRF-193則能挽救這種增殖(圖7C-E)。同樣,研究發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-47可促進PC3和LNCaP細胞的遷移能力(圖7F-I)和侵襲能力(圖7J和K),ICRF-193可緩解這種情況(圖7F-K)。
圖7
7、TOP2A可通過上調(diào)LDHA和糖酵解
為了研究TOP2A引發(fā)PCa進展的分子機制,分別將TOP2A siRNA轉(zhuǎn)染到PC3和LNCaP細胞中(圖8A)。對轉(zhuǎn)染了TOP2A siRNA的PC3細胞進行了RNA-Seq測序,富集分析顯示,TOP2A基因敲除對丙酮酸代謝、氧化磷酸化和癌癥中樞碳代謝有顯著影響(圖8B)。值得注意的是,丙酮酸代謝具有highest的富集指數(shù)(圖8B)。在丙酮酸代謝通路中的DEGs中,AKR1A1、ACOT12、LDHA、LDHC和ALDH7A1在TOP2A敲除后均表現(xiàn)出顯著且相似的下調(diào)(圖8C)。用qPCR驗證了TOP2A敲除對PCa細胞中AKRIAI、ACOT12、LDHA、LDHC和ALDH7A1mRNA水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TOP2A敲除后,PC3和LNCaP細胞中AKR1A1和LDHA的mRNA水平同時下調(diào)(圖8D)。此外,WB分析表明,TOP2A基因敲除后,PC3和LNCaP細胞中LDHA同時下調(diào),而AIfR1A1沒有下調(diào)(圖8D-E)。此外,來自TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進一步證實了這一正向相關(guān)性。在PCa患者中,TOP2A和LDHA的mRNA水平之間存在差異(圖8F)。此外,低劑量(0.01uM)BDE-47可上調(diào)PC3細胞中LDHA的蛋白水平,而TOP2A基因敲除可挽救LDHA的蛋白水平(圖8G)。此外,TOP2A過表達也會上調(diào)PC3細胞中LDHA的蛋白水平(圖8G)。此外,還發(fā)現(xiàn)敲除TOP2A會降低LDH活性(圖8H)、葡萄糖攝取量(圖8I)和乳酸濃度(圖8J),這意味著敲除TOP2A對PCa細胞的糖酵解有抑制作用。
圖8
接下來研究了TOP2A和LDHA的表達對PCa進展的影響。具體而言,體外實驗表明,TOP2A敲除抑制了PC3和LNCaP細胞的增殖(圖9A-C)、遷移(圖9D-G)和侵襲(圖9H和I)能力,而LDHA的過表達則可以挽救這些能力(圖9A-I)。
圖9
8、乳酸鹽通過H3K18的乳化作用促進TOP2A的轉(zhuǎn)錄
為了評估PCa細胞的組蛋白乳化情況,用一系列濃度的LA處理PC3細胞。結(jié)果顯示,用LA處理后,PC3細胞中TOP2A、總?cè)榛≒an-Kla)和組蛋白乳化(H3K18la)的蛋白水平呈劑量依賴性上調(diào)(圖10A)。此外,LDHA基因敲除會降低TOP2A、Pan-Kla和H3K18la的蛋白水平,而LA處理可以挽救這些蛋白水平(圖10B)。考慮到組蛋白乳化會調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,研究了組蛋白乳化是否會影響TOP2A的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LDHA敲除抑制了PC3細胞中H3K18與TOP2A啟動子的結(jié)合活性,而用LA處理后這一效應(yīng)被挽救(圖10C)。此外,LDHA敲除會降低TOP2A的mRNA水平,LA處理后可逆轉(zhuǎn)(圖10D)。這些結(jié)果表明,LDHA或乳酸可通過組蛋白乳酸化上調(diào)TOP2A的轉(zhuǎn)錄。此外,研究還發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-47可通過上調(diào)TOP2A/LDHA通路促進PCa的進展(圖1-9)。基于上述證據(jù),作者推斷低劑量BDE-47誘導(dǎo)了TOP2A/LDHA/乳酸化正反饋回路,從而進一步促進了PCa的進展。
圖10
總結(jié):本文有很多熱點研究內(nèi)容,顯得很新穎,另外還做了細致的實驗,有力的分析了BDE-47暴露對前列腺癌發(fā)展的影響機制!傲星生物深耕生信分析十余載,有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù),一對一專屬服務(wù)為您排憂解難,助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升!