想驗證miRNA與靶基因的作用? ——雙螢光素酶報告基因檢測

想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作?——雙螢光素酶報告基因檢測

想知道轉錄因子對下游基因的作用? ——雙螢光素酶報告基因檢測

沒錯，雙螢光素酶體系就是這么的強大!

雙熒光素酶報告基因通常以螢火蟲熒光素酶為報告基因，以海腎熒光素酶為內參基因。所構成的報告系統具有靈敏度高、動態范圍廣、應用靈活等優勢，廣泛應用于基因調控、非編碼RNA靶向互作等研究領域。今天，我們就來重點聊聊這個話題。

雙熒光素酶實驗的原理

將目的基因轉錄調控原件構建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達載體，構建成報告基因質粒，使這段序列調控luciferase的轉錄表達。然后將報告基因質粒轉染細胞，給予其不同的處理后裂解細胞，并加入底物熒光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin發出熒光(最強波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉錄調控原件的影響。為避免由于質粒轉染細胞時效率差異所造成的誤差，通常會轉入Renilla luciferase的報告基因質粒作為內參(最強波長在465nm左右)，即雙熒光報告系統。

螢光素酶實驗具體有哪些應用？

1、驗證microRNA同mRNA靶向互作。將待測基因的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，檢測熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

2、驗證microRNA同lncRNA靶向互作。將待測lncRNA序列插入報告基因載體的3’UTR區域，檢測熒光素酶活性。

3、啟動子結構分析。將啟動子區域(約2k左右)進行分段截短或突變，構建入報告基因載體，檢測熒光素酶活性。

4、啟動子SNP分析。一些基因的啟動子區域存在單核苷酸多態性，可運用熒光素酶報告系統分析其相對活性。

5、驗證信號通路是否激活。將該信號通路的下游相應原件序列構建入報告基因載體，檢測不同上游條件下，其熒光素酶活性，即下游信號通路的響應情況。

雙螢光素酶實驗的具體步驟

1、報告基因質粒的構建。將目的片段插入到熒光素酶表達的報告基因載體上，如pGL3-basic。

2、轉染細胞。將報告基因質粒和phRL-TK(內參)共轉染細胞，根據需要對細胞進行處理。共轉染時，由于內參具有很強的啟動子，因此報告基因質粒：內參轉染量一般為10:1~50:1。

Luciferase活性測定：

⑴ 初次使用時，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中，并分裝-80℃避光保存。

⑵ 加入1X PLB，室溫裂解細胞15 min。

⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能夠終止LAR II的反應。

⑷ 測定熒光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul細胞裂解液，吹打混勻后，檢測讀數，即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次讀數，即為Renilla luciferase的值。

⑸ 數據處理。首先計算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組的相對luciferase活性，也就是該處理組基因轉錄的調控活性。

實驗注意事項

1、為保證熒光素酶檢測試劑的穩定性可以采取適當分裝后避光保存的方法，以免反復凍融和長時間暴露于室溫。

2、為取得最 佳檢測效果，同一批樣品最好保證相同的測定時間，通常為10s。