原理

目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞碼作保護劑這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。

當細胞冷到零度以下，細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶;相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。

復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷，同時防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶，并防止DMSO在液體狀態下對細胞的毒害作用，快速使細胞進入復蘇和生長狀態。

用途

更新種子庫中的細胞及實驗需要

材料與儀器

[材料與試劑]待復蘇的細胞、100 X 雙抗、胎牛血清、相應細胞的培養基、75% 乙醇

[實驗儀器]37度恒溫水浴鍋、細胞培養血 (6cm)倒置相差顯微鏡、離心機、細胞房專用超凈臺、移液槍及移液槍頭 (無菌或滅菌后烘干)培養箱、移液管。

步驟

一、試劑準備 (以 293T 細胞為例)

1、DMEM 完全培養基 (10% 胎牛血清)44.5mL DMEM+5 mL胎牛血清+500 uL 100 X雙抗，搖勻，4°C 冷藏保存，使用前30 min放于細胞房中室溫預熱。

2、提前將水浴鍋打開，設置 37°C。

二、細胞復蘇

1、超凈工作臺使用前紫外線照射30 min，打開通風，用75% 酒精擦拭臺面，保持臺面干凈整潔。

2、將凍存細胞從-80°C 冰箱或液氮罐中取出，立即放入 (2 min 內，如從液氮中取出，粗需要待凍存管中漏進去的液氮揮發)37C 恒溫水浴中預熱水浴鍋中 (或在手心中反復摩擦) ，不停晃動以化凍，并盡量保持凍存管的管口不浸入水中。

3、在室溫下以1000 rpm的轉速將細胞懸液離心5 min并棄上清(離心的速度和時間根據細胞系的不同有所差異)。

4、用1 mL DMEM完全培養基重懸細胞，并轉移進6 cmm (每血中加入3-4 mL細胞懸液)中，搖晃均勻，放入37°C 恒溫細胞培養箱中 (5%CO2)。

5、過夜后 (~12h) ，觀察復蘇細胞的狀態，并及時 (每48 h) 更換DMEM完全培養基一次，并依據情況，決定是否需要重新凍存細胞保種。

6、懸浮細胞操作同上，培養基使用懸浮細胞培養基，培養皿為細胞培養瓶，37°C 細胞搖床 (5%CO2) 、110 rpm 。

注意事項

1、凍存記錄:保存凍存細胞的精確記錄是很重要的。需建立細胞生長史、名稱、傳代次數、凍存日期、復蘇次數、生長培養液和在凍存器中的位置都是應記錄的項目。

2、凍存液: 應用補充 10%~20% 胎牛血清的完全培養基和 10% 甘油或 DMSO。最佳凍存液配方在比較FBS 濃度 (10%~20%)，DMSO(5%~20%) 或甘油 (10%~15%) 濃度后決定

在低溫狀態保存數天后進行復蘇效率的比較。

3、DMSO具有細胞毒性，復蘇細胞的過程操作要迅速，并用 3 倍體積以上的完全培養基進行稀釋。

4、凍存細胞應選擇傳代次數較少的細胞，當細胞傳代高于15-20 代后，細胞應丟棄，復蘇新的細胞再進行試驗。

5、復蘇后的細胞不能立即進行試驗，等待細胞穩定后，傳代 2-3 代后，方可進行相關實驗。

6.復蘇過程中需要特別注意凍存管中是否漏入液氮，如漏有液氮需等液氮揮發后再放入水浴鍋中在水浴鍋中化凍時，盡量避免管口沾水，導致復蘇的細胞有發生污染的可能。

常見問題

1、復蘇細胞的狀態與凍存前以及復蘇過程都有關系，應選擇狀態較好的細胞進行凍存。

2、-80°C 凍存的細胞一般應在 3-6 個月內進行復蘇或處理。若想長久保存，應轉移進液氮中，可以保存1年以上。

3、.復蘇后細胞狀態不佳，可考慮重新復蘇，若重新復蘇后細胞狀態仍舊不佳，可考慮適當提高胎牛血清的用量 (從10%提升至15%，最大提升至20%)，待細胞狀態恢復后再使用平時使用的培養基。