實驗中關鍵步驟：

1. 充分脫蠟和水化。脫蠟前可先將切片在 60oC烤片 20 min，再使用二甲苯脫蠟2次，每次 5-10 min;而水化一般建議用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，便于后期試劑能充分、均勻的結合反應。

2. 把握好細胞通透的時間。一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 厚的切片用短時間;幾十 μm厚的 切片用長時間，通過摸索達條件使實驗過程做到既不脫片，也能夠使后面的酶或抗體進入胞內。

3. 適當延長 TUNEL 反應液的時間。一般是37oC孵育 1 h，也可以根據細胞的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至 2 h，但要結合實驗最終的背景著色來確定。

4. DAB 顯色條件的選擇。如果是用DAB顯色，一般 DAB 反應不超過10 min，可結合顯微鏡觀察控制背景顏色，有可能幾十秒種就能顯色。

5. PBS 的充分清洗。在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗請嚴格遵守清洗條件，次數可增加到 5 次，以降低切片的非特異性著色。

6. 內源性 POD 的封閉。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，可適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達到較好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。

細胞通透的時間選擇：

1. 蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜，從而使反應試劑能充分進入細胞核進行反應，提高陽性率。但濃度過高或孵育時間過長容易造成脫片，其作用類似與 TritonX100 等細胞通透劑。

2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,亦可自行將濃縮液配制1-10 mg/ml。蛋白酶K可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液(100 mM Tris HCl pH8.0, 50 mM EDTA)，分裝后-20oC保存。

3. 蛋白酶K反應時間一般為10-30 min，具體時間長短與切片厚薄有關，4 μm左右的片子可以通透 10 min，如切片厚度30 μm左右的可延長至30 min，需實驗摸索最佳時間。通透時間過長易脫片、過短起不到通透效果。

關鍵試劑操作條件：

1. DAB 顯色反應大約需要30s-5 min，要控制好反應時間，勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據切片組織來源和切片厚度、試劑盒說明摸索條件。

2. 蛋白酶K工作液處理時間、溫度須在范圍內摸索，溫度過高，時間過長，易造成脫片且可能破壞核酸結構，出現假陽性。

3. 陽性樣本的DNase 1處理一般建議室溫，10 min 即可。

如何減弱非特異性染色：

肝臟或腎臟，因富含內源性過氧化物酶，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時間、PBS 充分清洗，顯微鏡下把握好著色情況。

常見問題分析：