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分子實驗

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ELISA檢測

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一、實驗概念

酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,簡寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。酶聯免疫吸附測定(ELISA)為免疫學中的經典實驗。


二、實驗流程(具體步驟以說明書為準):

取出ELISA試劑盒→封閉→洗滌→加入一抗→洗滌→加HRP標記的二抗→洗滌→底物顯色→加入終止液→酶標儀讀數→數據分析


三、樣本要求

樣本形式

處理方式

保存

運輸

血清

干燥管(黃色)或促凝管(紅色)收集全血,室溫自然凝固10-20min,離心5-10min(2500-3500rpm/min)。采血過程中應避免溶血,仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心

-20℃或更低

冰袋或干冰

血漿

抗凝管(紫色、黑色、綠色)收集全血,采集后馬上混勻,靜置10min左右,離心5-10min(2500-3500rpm/min)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心

-20℃或更低

冰袋或干冰

尿液

用無菌管收集,離心10-20min(2500-3500rpm/min),仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心

-20℃或更低

冰袋或干冰

糞便

用無菌15ml離心管收集, 1g樣本+9ml PBS(0.01M,pH=7.4),充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min),取上清備用

-20℃或更低

冰袋或干冰

胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液

同尿液

-20℃或更低

冰袋或干冰

細胞

檢測分泌性的成份:用無菌管收集,5-10min(2500-3500rpm/min),仔細收集上清

-20℃或更低

冰袋或干冰

 

細胞內指標:吸去培養板內的培養基,胰酶消化細胞,收集細胞沉淀,PBS(0.01M,PH=7.4)清洗一次,PBS稀釋細胞懸液,細胞濃度達到1×107個/ml左右,充分研磨后超聲裂解(或反復凍融),以使細胞破壞并放出細胞內成份,離心5-10min(2500-3500rpm/min),取上清備用

 

 

動物組織

用無菌15ml離心管收集, 組織重量不能低于50mg,1g組織加入9ml PBS(0.01M,PH=7.4),手工或勻漿器將標本勻漿充分,勻漿過程中,PBS分2次加進去,這樣勻漿更充分。充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min)。取上清備用(切勿加入細胞裂解液)

-20℃或更低

冰袋或干冰

植物組織

用無菌15ml離心管收集, 組織重量不能低于50mg,1g組織加入9ml PBS(0.01M,PH=7.4),手工或勻漿器將標本勻漿充分,勻漿過程中,PBS分2次加進去,這樣勻漿更充分。充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min)。取上清備用(切勿加入細胞裂解液)

-20℃或更低

冰袋或干冰

牛奶

8000轉高速離心,離心后分三層,第一層是脂肪層,中間層是乳清,底層是固態蛋白,取中間層保存備用 。乳清量參照血清量。

-20℃或更低

冰袋或干冰

注意事項:
     1.避免反復凍融,樣本處理之后可分裝密封保存。4度保存應小于1周,-20度不超過3個月,-80度不超過12個月。在標本使用前應緩慢均衡至室溫,不應加熱使之融解。
     2.不能檢測含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性,從而導致假陰性的結果。

血常規樣本為EDTA-K2抗凝的全血樣本,抗凝管紫色頭蓋管,收集混勻不能凝血,樣本量不能少于0.2ml。當天檢測,此檢測為全套結果,不單獨檢測某一項或者幾項。
     凝血四項(凝血功能):包括凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB) 常見的凝血4指標。樣本為枸櫞酸鈉抗凝的全血樣本。
     以上兩種樣本采集樣本后需要在24h內進行實驗;
     樣本保存溫度為常溫,如果室溫超過37℃,需要低溫2-8℃保存運輸。


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